Узнать функцию каждого гена
Российские ученые открыли механизм генетической машины митохондрий, поломка которого приводит к системному заболеванию мозга
Лабораторные мыши с полностью поломанным геном METTL15 не только успешно родились, но и выглядели вполне нормально — вот только у них не все хорошо с памятью и сообразительностью. Они чаще, чем немутантные родственники, раз за разом идут в тупик или туда, где их чувствительно ударит током. Такие мыши еще и слабенькие: в тесте с плаваньем они быстрее сородичей сдаются, перестают бить лапками, и их приходится спасать, вылавливая сачком.
Так у профессора химического факультета МГУ и директора Института функциональной геномики МГУ, членакорреспондента РАН Петра Сергиева и его коллег появилась перспективная для медицинского применения линия мышей — модель для изучения некоторых человеческих болезней (в данном случае митохондриопатий, заболеваний, связанных с поломками в митохондриях — энергетических органеллах, «батарейках» живых клеток). Это довольно редкая удача: мутации в важных генах часто приводят к тому, что мыши нежизнеспособны, а в некоторых других генах практически никак не проявляются. Если мыши с поломанным геном живы, но болеют, становится ясно, что в данном случае проявился механизм какого-то заболевания или группы заболеваний.
Как часто бывает в науке, к практическим результатам ученых подтолкнул фундаментальный интерес — понять, как устроены различные механизмы работы живой клетки. Совсем недавно (в мае и июне 2022 года) у Петра Сергиева и его коллег вышли сразу две публикации, описывающие механизм работы некоторых митохондриальных генов: одна в International Journal of Molecular Sciences («Mitochondrial rRNA Methylation by Mettl15 Contributes to the Exercise and Learning Capability in Mice»), другая — в Nature («Mechanism of mitoribosomal small subunit biogenesis and preinitiation»). То, что статьи с участием российских ученых продолжают выходить в самых престижных международных журналах, уже хорошая новость; тем более отрадно, что речь идет об очень интересной науке. Статья в Nature, написанная в сотрудничестве с коллегами из Швеции, никак не связана с медицинской практикой: она посвящена реконструкции фундаментального механизма — созревания рибосомы в митохондриях.
Рибосомы — это молекулярные машины трансляции, то есть производства белков, фундаментального механизма работы всего живого. Геном записан в молекулах ДНК; отдельные гены, чтобы заработать, должны быть скопированы в молекулы матричных РНК (транскрипция), а уже на этой РНК, как на матрице, рибосома делает белки, из которых состоит все живое — ферменты, структурные элементы, двигательные машины и прочие нужные для клетки вещи (трансляция).
Рибосомы состоят из нескольких молекул РНК, скрепленных при посредстве белков в очень сложную и большую структуру; это целая молекулярная фабрика. Чтобы ее сделать, нужен не только строительный материал, но и белки-ферменты, которые помогают РНК и белкам соединиться правильно. То, что происходит в клетках на молекулярном уровне, не похоже ни на «ирландское рагу», ни на хаотическое смешение компонентов в химической колбе. Ученые не перестают удивляться тому, насколько тонко и четко действуют все механизмы. Для сборки одного из фрагментов митохондриальной рибосомы нужны как раз те гены, которые изучил Петр Сергиев с коллегами. METTL15, мутация в котором понижает интеллект у мышей, кодирует фермент метилтрансферазу, химически модифицирующий рибосомальную РНК, что позволяет ей принять нужную для работы форму, правильную структуру. Очевидно, митохондрии с такой мутацией все же могут работать: рибосома конструируется не настолько неправильно, чтобы мыши оказывались нежизнеспособными. Кроме указанного гена были описаны и другие, и стал ясен весь путь созревания рибосом в митохондриях.
Этот механизм был рассмотрен впервые. Рибосомы в бактериях (в том числе благодаря предыдущим работам Сергиева и коллег) известны уже хорошо, рибосомы в цитоплазме животных клеток тоже изучены, а вот процесс созревания рибосом для производства белков в митохондриях стал понятен только сейчас. И он оказался непохожим ни на бактериальный механизм, ни на механизм рибосом в цитоплазме более сложных эукариотических организмов.
По современным представлениям, эукариотические клетки (с ядрами, митохондриями и прочими сложностями), из которых состоят в том числе и люди, возникли в процессе эволюции 1,6–2,1 млрд лет назад, и это одна из самых вдохновляющих историй. Согласно гипотезе, кажущейся сейчас наиболее правдоподобной, эволюционный прорыв случился не в результате конкуренции и борьбы за существование, а в результате самой важной в истории живых существ кооперации. Считается, что древняя архея (одноклеточный организм без ядер) в какой-то момент проглотила бактерию. Проглотила, но не стала ее переваривать. Непереваренные бактерии продолжили работать и превратились в хлоропласты растений, отвечающих за фотосинтез, и в митохондрии, отвечающие за дыхание и производство энергии. Это подтверждается тем, что у митохондрий есть свой геном, отличающийся от генома, который хранится в ядре, и этот геном — явный наследник генома бактерий. То есть в каждой нашей клетке живут потомки древних бактерий, без которых мы бы не могли существовать.
Правда, в ходе эволюции геном митохондрий постепенно уменьшался, гены перекочевывали в ядро, к основному геному, но какие-то гены сохранились, в том числе METTL15. Он пришел от древних бактерий и необходим для правильной сборки рибосомы, а значит, и в целом для нормального функционирования митохондрий.
О том, как проводился научный эксперимент, как связаны прикладные результаты и фундаментальные исследования и как в принципе устроена логика научного поиска в современной биологии, Петр Сергиев рассказал «Эксперту».
Петр Владимирович Сергиев 1 июня 2022 года на выборах в Российской академии наук был избран членом-корреспондентом Отделения биологических наук (инженерная биология и генетические технологии).
Родился в 1973 году в Москве. В 1995 году окончил химический факультет МГУ. Научные интересы плотно связаны с изучением синтеза белков в клетке и работы рибосом. В 1998 году защитил кандидатскую диссертацию, посвященную новым химическим методам изучения рибосом. В 2000 году получил Шуваловскую премию за изучение структуры и функций одной из рибосомальных РНК. Докторская диссертация 2008 года посвящена молекулярным аспектам функционирования рибосомных РНК. С 2012 года Петр Сергиев — профессор кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ. В 2018 году стал лауреатом премии им. М. В. Ломоносова за цикл работ «Высокопроизводительная система поиска и определения механизма действия антибиотиков».
Особенности мутантных мышей
— Что стало с мышками после вашего эксперимента с митохондриями?
— Мышки стали немножко туповатыми.
— Почему?
— Доподлинно неизвестно. С помощью генного редактора мы им выключили ген METTL15. Он отвечает за модификацию митохондриальных рибосом, которые нужны для синтеза митохондриальных белков. Видимо, мыши поглупели, потому что их нейроны перестали получать должное количество энергии. Даже небольшое несовершенство в аппарате сборки рибосом приводит к таким последствиям.
— Какие тесты провалили мыши без METTL15?
— Во-первых, они плохо сдали тест на силу. Мыши, если их поднести к проволочке, автоматически за нее хватаются. И в этот момент мы их чуть-чуть тянем. Они какое-то время держатся, а потом отцепляются. Так можно измерить, с какой силой они держатся.
Еще есть принудительное плавание: мышь бросают в воду, она там плавает, а потом сдается: дескать, все, я устала. Когда это происходит, мы выключаем секундомер и вылавливаем ее сачком.
И есть тест на обучение с отрицательным подкреплением. Перед мышкой две камеры, светлая и темная. Разумеется, мышка будет стремиться в темную. Но в темной ее бьют током — это не смертельно, но неприятно. И она запоминает, что в темную камеру ей заходить не надо. Или не запоминает.
Во всех тестах наши мышки показывали не самые выдающиеся результаты: они и за проволочку слабо держались, и плавали меньше, и забывали, где их били током. То есть оказались не только глупыми, но и слабыми.
— Как-то вы сказали, что одна из задач ученого — устанавливать причинно-следственные связи. Но можно увлечься и, например, сделать вывод, что таракан слышит ногами, потому что если пошуметь, он убежит, а если ему ножки оторвать — останется на месте. Как избежать неверных выводов в данном случае?
— Мы, естественно, не утверждаем, что функция METTL15 в том, чтобы мыши были умными и сильными: это было бы равнозначно выводу, что таракан слышит ногами. Просто фермент метилтрансфераза, который закодирован этим геном и модифицирует рибосому, косвенно влияет на интеллектуальные способности и общую выносливость организма.
Рибосома — машина сложная. И сборка ее сложная. Это такой многоэтапный конвейер, когда разные белки, как роботы, присоединяют, модифицируют и перестраивают структуру РНК, которая является основой рибосомы. И все это должно происходить скоординированно и последовательно. Маленькое нарушение — и система ломается.
Доподлинно мы установили, что фермент метилтрансфераза METTL15 участвует в сборке митохондриальных рибосом — молекулярных машин, которые синтезируют белки в митохондриях.
— Почему возникло это исследование?
— Вообще, как ученому, мне интересно выяснить функции генов. Гены — это инструкции к тому, как сделан организм. И этих инструкций около 20 тысяч. И у нас, и у мышки около 20 тысяч генов — это не так много, ученых гораздо больше. Так что вполне разумная и посильная задача — узнать функцию каждого гена. И мы к ней потихоньку движемся.
Как появилась идея изучать именно этот ген? Мы знали, что митохондриальные рибосомы модифицируются: к ним присоединяются некие химические добавки и происходит что-то вроде молекулярного тюнинга. До нашей работы было непонятно, кто этот тюнинг делает. Оказалось, ген METTL15.
— Митохондриальные рибосомы надо специально «тюнинговать», химически модифицировать?
— Есть биополимеры, которые синтезируются стандартным путем: ДНК → РНК → белок. РНК синтезируется РНК-полимеразой. В состав РНК входят четыре стандартных нуклеотида («буквы» генетического кода): аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), урацил (У). Это обычно, по умолчанию. Но выяснилось, что после синтеза РНК некоторые нуклеотиды химически видоизменяются — с помощью ферментов. И мы изучаем, как они изменяются и почему. Раз в природе придуман специальный фермент, чтобы модифицировать один нуклеотид из 900 внутри митохондриальной субъединицы рибосом, значит, это точно зачем-то нужно.
— И вы нашли два гена, которые модифицируют РНК рибосомы, верно? Чем они друг от друга отличаются?
— Да, сначала мы нашли два не очень понятных гена — ученые не знали, для чего они. Потом стало ясно: тот и другой занимаются рибосомами — машинками, которые делают белки.
Интересно, что у этих генов оказалась разная эволюционная история: один достался нам от бактерий, а второй появился намного позже, когда образовались позвоночные. METTL15 имеет бактериальную природу — у бактерий есть похожий ген. Представляете, какая-то древняя архея съела бактерию и образовались мы, эукариоты, — а в наследство получили два аппарата биосинтеза белков и, что удивительно, аппарата модификации рибосом! С тех самых пор в наших митохондриях работает, по сути, бактериальный фермент, METTL15.
А второй ген, который мы нашли, TRMT2B, возник гораздо позже — когда образовались позвоночные. В этот момент произошло удвоение генома. С тех пор у нас многие гены как бы парные. У беспозвоночных был один ген, а у нас, позвоночных, два похожих. И эти похожие гены начали по-разному специализироваться.
У беспозвоночных предковый ген занимался «тюнингом» тРНК — маленькой молекулы, которая переносит аминокислоты. У нас с вами этот ген удвоился. Один так и продолжил заниматься тРНК в цитоплазме, а другой — TRMT2B — стал митохондриальным и занимается модификацией рибосомальной РНК в митохондриях.
— И они не взаимозаменяемые, не дублируют друг друга? Два похожих механизма, которые работают на разных стадиях созревания рибосомы?
— Да, это просто разные модификации, разные прибамбасы, которые присоединяются к этой молекулярной машинке.
Как делается современная генетика
— Как долго шла эта работа, какие этапы вы в ней выделяете?
— С мышами любая работа занимает годы. Хотя, казалось бы, плодятся они довольно быстро. Но нам ведь нужна не обычная мышь, а мышь с отредактированным геномом.
Сначала нужно сделать генетическую конструкцию — эта работа занимает около двух недель. Потом, чтобы забрать у мышки яйцеклетки, необходимо провести суперовуляцию — это еще несколько дней. После микроинъекции генного редактора яйцеклетку подсаживают обратно мышке. Беременность у нее длится примерно три недели. Затем рождаются мышата — им нужен месяц на половое созревание. Но, как правило, они начинают размножаться с двух месяцев. Получается, только три месяца у нас уходит на то, чтобы появилась нужная мышка.
Но ею дело не ограничивается. Этих мышек надо еще размножать. Так мы получаем гетерозиготных мышек, у которых одна хромосома несет ген дикого типа, а другая — мутантный. Таких мышей потом тоже нужно друг с другом скрещивать, чтобы получить гомозиготный нокаут, то есть мышь, у которой инактивированы, отключены обе копии гена.
Другими словами, только на подготовительную работу, на то, чтобы получить мышей для опыта, нужно потратить почти год. Сам опыт тоже довольно длительный. Конкретно этот у нас занял примерно шесть месяцев, а на всю работу ушло полтора года. И это еще на самом деле довольно быстро.
— Бывает дольше?
— На другую работу у нас ушло пять лет. Она связана с крошечным пептидиком. Началось все с того, что для исследования мы выбрали ген некодирующей РНК, то есть предполагалось, что в ней не закодировано никакого белка. Но потом мы выяснили, что там все же закодирован митохондриальный пептид, просто он очень маленький и раньше его никто не замечал. Мы его изучили и поняли, что он важен для дыхания, для митохондриальных мембран. Вскоре, я очень надеюсь, опубликуем статью.
— Если очень упрощать, то ваша работа сводится к тому, чтобы выключать те или иные гены и смотреть, что будет, верно?
— Именно так.
— Как вы выбираете, какой именно ген отключить?
— Из разных соображений. Одни — потому что у нас есть гипотеза о том, что именно эти гены делают, и мы просто ее проверяем. Другие — потому что думаем, что их, кроме нас, никто не будет изучать. Хотя, как правило, ошибаемся. Казалось бы, мы выбираем никому не интересные гены, а потом выясняется, что еще три научные группы включились в эту гонку и нам надо довольно жестко с ними конкурировать.
Третья причина — мы выбираем гены, на которые нас просят обратить внимание медицинские генетики. Порой они наблюдают у своих пациентов мутации и им хочется проверить, действительно ли эти мутации вызывают болезнь.
— И по какой из этих трех причин вы решили отключить ген METTL15?
— Скорее по второй. Митохондриальная трансляция изучена хуже, чем трансляция в цитоплазме. При этом у нас есть опыт изучения генов и, соответственно, белков, которые отвечают за модификацию РНК, так что начинали мы не с чистого листа.
— Вы выясняете, где находятся нарушения и как их исправить или вопрос пока в том, как все устроено?
— Мы работаем над разными вещами. Я считаю, что не надо замыкаться только на генах, которые важны для медицинского применения. Надо просто изучать гены. Возьмите тот же CRISPR/Cas («молекулярные ножницы», самая популярная и точная на сегодняшний день технология редактирования геномов. — «Эксперт»), про который столько разговоров и который мы тоже применяем. Довольно долго им никто не занимался, потому что это были никому не интересные повторы в археях и бактериях. С ними работал лишь один энтузиаст, Франсиско Мохика, и нигде не мог опубликовать свои исследования — их не считали особенно важными. В тот момент никто не думал, что CRISPR/Cas будет геномным редактором.
Так и мы не вполне можем представить, какое значение будет иметь изучение того или иного гена. Просто нужно, как в эпоху великих географических открытий, проверять все белые пятна на карте, смотреть, нет ли там островов. А уж есть ли на этих островах нефть, золото или что-нибудь еще, покажет будущее.
Мы, конечно, делаем и модели заболеваний — без этого никуда. Как я уже сказал, сотрудничаем с медицинскими генетиками: они находят у пациентов какие-то новые мутации, а мы их пытаемся воспроизвести у мышей. Сейчас у нас в работе несколько таких моделей. Например, совместно с исследовательским центром онкологии имени Петрова мы «делаем» мышек, у которых есть предрасположенность к раковым опухолям. У нас существуют некоторые гипотезы, но до тех пор, пока не сделана мышиная модель, их нельзя считать доказанными.
— Митохондрии имеют бактериальное происхождение. А у бактерий, как известно, есть признаки иммунной системы, на основе чего и была создана технология CRISPR/Cas. Есть ли такая же или похожая система у митохондрий?
— Нет, в митохондриях ничего такого нет, потому что у них редуцирован геном — они избавились почти от всего. Оставили только компоненты дыхательной цепи — те белки, которые нужны нам для дыхания. Все остальное митохондрии передали в клеточное ядро.
— Какие заболевания ассоциируются с нарушением работы тех самых метилтрансфераз — ферментов, которые химически модифицируют РНК и с которыми связаны ваши последние работы?
— С метилированием РНК связано не так много заболеваний, известных человеку. Есть метилтрансфераза, при инактивации которой мышка просто не рождается. Есть метилтрансфераза, которая вызывает небольшие изменения, и надо попотеть, чтобы их найти. Но есть у нас и маленькое открытие. Не хотелось бы раскрывать все наши секреты, потому что это пока неопубликованные данные, но мы исследуем РНК-метилтрансферазу, которая работает в семенниках. Известно, что ее мутации вызывают мужское бесплодие. И мы увидели, что у мышей с этой мутацией нарушена структура хвоста сперматозоида. Там есть такие продольные тяжи — в норме они располагаются друг напротив друга, а в мутанте смещены. Когда мы закончим эту работу, сможем рассказать подробнее.
— Линия мышей, которая у вас появилась, является моделью заболеваний, связанных с поломками митохондрий. А что делать с этими заболеваниями в будущем? Что перспективней: лечить «больные» митохондрии или трансплантировать здоровые?
— Ни то ни другое пока невозможно. Но трансплантировать, кажется, проще. В митохондрии человека нельзя поместить РНК, поэтому там не работает всем известный геномный редактор CRISPR/Cas, хотя экспериментов было много. С другой стороны, есть белковые редакторы, которые можно транспортировать в митохондрию. И все-таки с точки зрения медицинского применения легче было бы трансплантировать митохондрии… Впрочем, не станем торопиться с выводами, это дело будущего.
— Если представить, что маленькая митохондрия — это огромный дворец, в котором сотни палат, сколько комнат в этом дворце вы обошли и знаете, для чего они предназначены?
— Наша заслуга только три гена. А всего там около полутора тысяч разновидностей белков. То есть в этот дворец мы только вошли. Радует, что над этим работаем не мы одни.
Фотографии из личного архива Петра Сергиева
Хочешь стать одним из более 100 000 пользователей, кто регулярно использует kiozk для получения новых знаний?
Не упусти главного с нашим telegram-каналом: https://kiozk.ru/s/voyrl